UHPLC-HRAM MS鉴定司美格鲁肽降解产物及杂质

1.前言

化学合成多肽是介于小分子化学药物和蛋白质药物之间的一类药物，与小分子化学药物相比，其在制备工艺、结构确证和质量研究等方面均具有特殊性。多肽药物的工艺杂质一般包括氨基酸缺失、取代或插入肽、截断肽、异构体等;降解杂质一般包括乙酰化杂质、脱酰胺杂质、二硫键错配杂质、氧化杂质、消旋体、β-消除杂质、低聚物等。欧洲药典将多肽药物相关杂质的报告限、鉴定限和界定限分别规定为0.1%、0.5%和1.0%。FDA规定多肽类化学仿制药(胰高血糖素、利拉鲁肽、奈西立肽、特立帕肽和替度鲁肽)的鉴定限和界定限分别为0.1%和0.5%，其他多肽药物遵循具体问题具体分析的原则"。2023版《化学合成多肽药物药学研究技术指导原则(试行)》规定多肽相关杂质的报告限、鉴定限和质控限为0.1%、0.5%和1.0%。若发现多肽药物杂质存在安全性隐患，应适当收紧杂质限度要求。

司美格鲁肽，结构见图1，是一种长效的胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide-1,GLP-1)受体激动剂，适应症有糖尿病、糖尿病肾病及肥胖等。司美格鲁肽现有的合成工艺分两类，一类是原研选择的生物发酵结合化学合成的方法完成成品的制备;一类是多肽固相合成以及片段缩合的合成方法。多肽合成工艺过程产生的杂质如氨基酸缺失、取代或插入肽、截断肽等，这些杂质与目标多肽的性质接近，给常规反相液相色谱的分离带来挑战。司美格鲁肽及其相关杂质的反相液相色谱分离使用酸性磷酸氢二铵作为流动相，而磷酸氢二铵是质谱不兼容的流动相。

二维液相(2D-LC)是一种不改变一维液相分离度且能在线对杂质和目标多肽进行高效鉴定的途径。多中心切割2D-LC可以实现一针样品在线切割多个杂质，然后通过二维泵依次冲洗到二维色谱柱中进行除盐、洗脱和质谱鉴定，图2为仪器流路图。

2.实验方法

2.1仪器

Thermo Fisher Vanquish Duo多中心二维液相色谱仪串联高分辨质谱Orbitrap Exploris 120泵:Binary Pump F(P/N:VF-P10-A)

Binary Pump F (P/N:VF-P10-A)自动进样器:Split Sampler FT(P/N:VF-A10-A)柱温箱:Column Compartment H(P/N:VH-C10-A)

Column Compartment H (P/N:VH-C10-A)WWD检测:Variable Wavelength Detector F(P/N:VF-D40-A)质谱检测器:Orbitrap Exploris 120(P/N BRE725531)

2.2试剂

磷酸二氯铵(HPLC级，CNW)、异丙醇(HPLC级，Merck)、乙腈(LC-MS级，Fisher)、甲酸(LC-MS级，CNW)、去离子水(18.2MO，Millipore纯水机)。

2.3样品信息

司美格鲁肽固体粉末，来自客户企业。称取适量样品用超纯水溶解至1.35mg/mL

2.4色谱条件

"若一维和二维一起运行，一维的运行时间根据二维适当延长

二维单个loop运行时间见表2，若是分别将5个loop中的馏分依次进到二维分析，则需要将表2的梯度进行5次循环。

3.实验结果

3.1一维方法重复性本文采用Hypersll gold peptide 小粒径色谱柱和 Vanquish Flex超高效液相对司美格鲁肽原料药进行纯度分析，连续进样3次，色谱结果重复性好，见图3和表4。

3.2多中心2D-LC-MS鉴定

面积归一法进行峰面积计算，对于图4中含量远低于0.1%的峰peak1，分别进行5次在线Io0p富集，考察在线富集效果。peak1未在线富集进行二维除盐后的质谱图见图5的A和C，C为质荷比1032处放大;peak1进行在线富集5次后进行二维除盐后的质谱图见图5的B和D，D为质荷比1032处放大，可以看出在线富集效果显著，质谱图的响应达到2.4E，可以进行有效数据解析。peak1单同位素分子量4125.1021Da,在线富集5次后的二级碎片离子覆盖度见图6。图4中含量高于0.1%的peak2-peak11及主峰，进行直接在线除盐和质谱鉴定。图7和图8展示主峰前的 peak2和 peak3的质谱定性结果。通过.上述方法结合Thermo BioPharmaFinder5.3软件鉴定该司美格鲁肽的杂质有氧化肽、酰胺化肽、缺失肽等。

4.结论

1、利用Hypersil gold peptide专用色谱柱和超高效液相色谱 Vanquish Flex能对该司美格鲁肽原料药的纯度进行较好的分离，且重复性好。

2、多中心2D-LC-MS对含量非常低的peak1进行在线富集再除盐进质谱响应，比未富集的peak1的质谱响应明显提高。未富集的peak1的质谱数据质量没法进行解析。通过此在线富集方式，可以提高至少5倍的检测灵敏度，该方法对于低含量的物质的鉴定，具有很好的借鉴价值。

3、本方法对于含量不低于0.1%的杂质和主峰进行至少一次实验可以切割5个馏分，然后依次在线除盐进质谱鉴定，鉴定出该司美格鲁肽具有杂质:W25氧化肽、E21酰胺化肽、缺失肽等。多中心2D-LC方法相比较传统的单中心2D-LC方法效率提高5倍。

4、借助变色龙软件eWorkfow的优势，该方法可以便捷地转移到各种多肽类药物、小分子药物、生物药等2D-LC-MS的杂质鉴定。

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