利用 Agilent 1290 Infinity III 荧光检测器高灵敏检测黄曲霉毒素

    黄曲霉毒素是农作物生产和储存过程中农作物上生长的霉菌产生的霉菌毒素。自然界中常见的黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2，以及它们的降解产物黄曲霉毒素M1和M2。由于黄曲霉毒素具有强毒性和致癌性，依据政府相关法规，必须进行监测，确保将其浓度控制在尽可能低的限值范围内。然而，采用紫外检测法测定黄曲霉毒素浓度，灵敏度往往达不到要求。但黄曲霉毒素在特定激发波长下具有荧光特性。以往，需要进行柱后衍生化(例如溴化)来增强黄曲霉毒素的荧光活性。借助高灵敏度的1290InfinityIIIFLD，可省去该步骤，从而节省时间与成本。本应用简报介绍了无需柱后衍生即可高灵敏度检测黄曲霉毒素的方法，并获得了极低的LODs与LOQs。

仪器设置

Agilent 1290 Infinity IIl 高速泵(G7120A)1Agilent 1290 Infinity IIl Multisampler (G7167B)Agilent 1290 Infinity IIl高容量柱温箱(G7116B)Agilent 1290 Infinity IIl FLD (G7123B),配备 13 pL 流通池(部件号G7123-60500)

软件

Agilent OpenLab CDS 2.8 

色谱柱

Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18, 2.1 x 100 mm, 1.8 um(部件号959758-902)

标准品

- 安捷伦黄曲霉毒素B1，10ug/mL，溶于乙腈(部件号TOX-UNI-AFLAB1)

安捷伦黄曲霉毒素B2，10g/mL，溶于乙腈(部件号TOX-UNI-AFLAB2)

安捷伦黄曲霉毒素G1，10pg/mL，溶于乙腈(部件号

TOX-UNI-AFLAG1)

安捷伦黄曲霉毒素G2，10ug/mL，溶于乙腈(部件号TOX-UNI-AFLAG2)

安捷伦黄曲霉毒素M1，1pg/mL，溶于乙腈(部件号TOX-UNI-AFLAM1)

安捷伦黄曲霉毒素M2，1pg/mL，溶于乙腈(部件号TOX-UNI-AFLAM2)

校准

储备液:1 ug/mL黄曲霉毒素G1、G2、B1、B2、M1和M2，溶于乙腈

系列稀释液:100000、50000、20000、10000、2000、1000,200, 100,20,10,2, 1,0.2 ng/L (fg/pL). 70:30水/(ACN:MeOH(1:1))进行稀释

溶剂

Agilent InfinityLab 乙腈 (HPLC专用)(部件号5191-5100-002)

Agilent InfinityLab 甲醇 (HPLC 专用)(部件号5191-5110-002)

Agilent InfinityLab水 (HPLC专用)(部件号5191-5120-002)

结果与讨论

天然存在的曲霉毒素G1、G2、B1、B2及其降解产物黄曲霉毒素M1和M2属于强毒性和强致癌性化合物。因此，必须对它们进行低个位数ng/L(fg/L)级别的超灵敏检测，尤其是在花生或乳制品等食品中。值得注意的是，这类化合物具有荧光活性，有助于在尽可能减少基质干扰的情况下实现高灵敏度检测。为了证明1290InfinityIIIFLD满足高灵敏度检测要求，针对上述黄曲霉毒素绘制了校准曲线，浓度范围跨越五个数量级，从100000 ng/L(fg/L)到1 ng/L(fg/L)。图1A为FLD测得的六种黄曲霉毒素在1、2、10和20ng/L浓度下的叠加图，图1B为FLD测得的六种黄曲霉毒素在100000、50000、20000和10000ng/L浓度下的叠加图。所有检测均在UHPLC条件下完成，使用内径为2.1mm的亚2微米填料色谱柱，总运行时间为5分钟。

在1-100000ng/L范围内测量了各黄曲霉毒素的校准曲线(图2)。所有R2均达到0.99998或更高。

在计算LOD和L0Q时，使用了1ng/L和2ng/L校准点(图3)。LOD按信噪比(S/N)为3时计算，LOQ按S/N为10时计算。所采用的噪声为通过OpenLabCDS得到的峰-峰(P2P)噪声。

图3下方的色谱图显示了黄曲霉毒素G1和M1在接近其定量限(2ng/L)浓度下的出峰情况;图3上方的色谱图显示了黄曲霉毒素G2、B1、B2和M2在接近其定量限(s1ng/L)浓度下的出峰情况。计算结果汇总于表1。图3中两张色谱图的进样量有所不同，上方色谱图中各黄曲霉毒素的柱上进样量为5fg，下方色谱图为10fg。

最后，对1000ng/L校准点重复测定10次，计算保留时间、峰面积RSDs、峰对称性和拖尾因子等峰性能参数。保留时间RSDs均低于0.15%，峰面积RSDs低于0.38%(表2)。

结论

本应用简报证明，Agilent 1290Infinity III荧光检测器无需柱后衍生化即可高灵敏度检测具有荧光活性的黄曲霉毒素，灵敏度可达个位数fg/pL水平。黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1、M2和M1的LODs均低于1fg/L。在1-100000ng/L五个数量级的定量校准范围内，表现出优异的线性。

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